I rapporti di Leonardo con lo "Spedale" di Santa Maria Nuova sono documentati, oltre che nel suo testamento, anche in diversi momenti della sua vita. Qui egli aveva la sua banca, depositava casse con libri a stampa, manoscritti e libri di disegni. Sempre qui eseguiva studi anatomici.
Lasciando Milano alla fine del 1499, Leonardo trasferì a Firenze, nel "banco" di Santa Maria Nuova, 600 «fiorini d’oro larghi in oro». Negli anni successivi ne ritirò 400. Prima di ripartire per Milano, il 20 maggio 1506, ne prelevava ancora personalmente 50 e quindi ne restavano 150 che, in base all’impegno stipulato in Santa Maria Nuova il 30 maggio seguente, servirono come cauzione, in favore della Signoria di Firenze, per obbligarlo a rientrare in città entro 3 mesi, pena la perdita del denaro. Garante era Leonardo di Giovanni Buonafé, efficiente "spedalingo" (hospitalarius) di Santa Maria Nuova dal 1500 per tre decenni e celebre anche quale committente di artisti come Pontormo, Rosso Fiorentino, Benedetto da Maiano, e Giovanni della Robbia.
Leonardo non rientrò in tempo a Firenze e la Signoria potè incamerare i suoi 150 fiorini, chiedendo anche che le fossero resi «indietro li denari presi per l’opera", la Battaglia di Anghiari, per la quale aveva «solo dato uno piccolo principio a un’opera grande».
Il 10 ottobre 1513 depositò a Santa Maria Nuova personalmente 300 scudi di sole (moneta francese). Nel suo testamento del 23 aprile 1519, redatto in Amboise: «ordina et vole che la summa de’ 400 scudi del sole che ha in deposito in man del camerlingo de’ Sancta Maria de Nove nella città de Fiorenza, siano dati alli suoi fratelli carnali residenti in Fiorenza, con el profitto et emolumento che ne può esser debito fino al presente de’ prefati camerlenghi…».
Un foglio autografo di Leonardo conservato nella Biblioteca Reale di Windsor confuta la leggenda secondo la quale rubasse i cadaveri, per utilizzarli segretamente come modelli per i propri disegni. È lo stesso Leonardo a raccontare come agisse in piena legalità e procedesse con grande umanità: «E questo vecchio, di poche ore innanzi la sua morte, mi disse lui passare cento anni e che non si sentiva alcun mancamento nella persona, altro che debolezza. E così, standosi a sedere sopra uno letto nello spedale di Santa Maria Nova di Firenze, senza altro movimento o segno d’alcuno accidente, passò di questa vita. E io ne feci notomia, per vedere la causa di sì dolce morte: la quale trovai venire meno per mancamento di sangue e arteria, che notria il core e li altri membri inferiori, li quali trovai molti aridi, stenuati e secchi. La qual notomia discrissi assai diligentemente e con gran facilità, per essere privato di grasso e di omore, che assai impedisce la cognizione delle parte. L’altra notomia fu d’un putto di due anni, nel quale trovai ogni cosa contraria a quella del vecchio.»
Una tradizione, che risulta essere soprattutto leggenda anziché storia documentata, narra di grandi vasconi di pietra situati nei sotterranei dell'Ospedale e utilizzati per i cadaveri studiati da Leonardo. Questo è un elemento straordinariamente suggestivo ma, allo stato attuale delle conoscenze, ancora da approfondire.